如何去除巨噬細(xì)胞？

    如何去除巨噬細(xì)胞？目前清除巨噬細(xì)胞常用的是clodronate liposomes，由荷蘭的Nico  van  Rooijen教授研發(fā)。目前已成立公司Liposoma B.V.

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去除巨噬細(xì)胞（depletion of macrophages）是研究巨噬細(xì)胞功能的重要方法。荷蘭阿姆斯特丹Vrije University的Nico van Rooijen教授開發(fā)的一款Clodronate liposomes，可以利用巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制，將膜不通透性的氯磷酸（Clodronate）帶入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到去除巨噬細(xì)胞的目的。

作用原理：

兩親性磷脂分子在水中可以形成同心圓形式的磷脂雙分子層球體，磷脂雙分子層中間通過水相分隔。溶解在水溶液中的氯磷酸鹽在形成脂質(zhì)體的過程中被包裹進(jìn)磷脂雙分子層之間的水相中（如圖1）。游離的氯磷酸鹽不能自由的通過脂質(zhì)體的磷脂雙分子層。隨著脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞吞噬，在巨噬細(xì)胞溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質(zhì)體水相中的氯磷酸鹽就可以被逐步釋放出來，并累積在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)其達(dá)到一定濃度時，巨噬細(xì)胞將會受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷，從而進(jìn)入凋亡過程（如圖2）。從死亡的巨噬細(xì)胞中釋放出來的氯磷酸鹽在細(xì)胞外的半衰期極短（大約15min），可以通過泌尿系統(tǒng)排除體外。

 

圖1：氯磷酸-脂質(zhì)體（Clodronate liposomes）復(fù)合物。在脂質(zhì)體的形成過程中氯磷酸通過溶解在水溶液中被包裹進(jìn)磷脂雙分子層之間的水相中。

 

圖2：巨噬細(xì)胞清除原理。包裹著氯磷酸（方塊）的脂質(zhì)體通過巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，與溶酶體（L）融合后，在磷脂酶(箭頭)的作用下，釋放出氯磷酸，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氯磷酸的濃度達(dá)到一定濃度，就會對巨噬細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，從而迫使其進(jìn)入細(xì)胞凋亡。

產(chǎn)品性質(zhì)：

1ml脂質(zhì)體體懸液中所含的氯磷酸大約為5mg。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na₂HPO₄，10 mM NaH₂PO₄，140 mM NaCl。

脂質(zhì)體體內(nèi)注射：

隔日尾靜脈注射200μl Clodronate liposome，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制定注射日程。通過免疫組化或流式檢測巨噬細(xì)胞去除效率。

尾靜脈注射方法：

（1）將小鼠放在倒扣的飯盒內(nèi)，從孔口拉出尾巴，小鼠的尾部有2條動脈和3條靜脈，2條動脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面，3條靜脈呈品字型分布,一般采用左右兩側(cè)的靜脈；

（2）將紗布浸泡于約70度的溫水中，拿出后包裹尾巴，以達(dá)到使尾部血管擴(kuò)張及軟化表皮角質(zhì)的目的；

（3）行尾部靜脈注射時，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2cm一段，使皮膚緊張，靜脈更為充盈，右手持1ml針頭注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/4處進(jìn)針，開始注入藥物時應(yīng)緩慢，仔細(xì)觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現(xiàn)，說明已刺入血管，可正式注入藥物。

（4）有的實(shí)驗(yàn)需連日反復(fù)尾靜脈注射給藥，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始，按次序向尾根部移動，更換血管位置注射給藥。拔出針頭后，用棉球按住注射部位輕壓1-2min，止血。

效果展示：案例一：案例二：

左圖顯示的是正常脾臟細(xì)胞中陽性巨噬細(xì)胞的染色結(jié)果。右圖為Clodronate-liposome注射2天后觀察的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)只剩下少量的巨噬細(xì)胞。左圖表示正常肝臟細(xì)胞中陽性的Kupffer細(xì)胞。右圖表示Clodronate-liposomes注射2天后，肝臟Kupffer細(xì)胞染色結(jié)果，Kupffer細(xì)胞基本被清除。

FAQ:

Q:收到Clodronate liposomes后該如何操作？A:收到氯磷酸脂質(zhì)體后，如果不能馬上使用，需要放置在4℃冰箱。禁止凍存！使用時作為原液使用，不能進(jìn)行稀釋。脂質(zhì)體很容易發(fā)生沉淀，建議使用之前輕輕混勻，另外4℃的氯磷酸脂質(zhì)體不能馬上使用，需要恢復(fù)到室溫才能進(jìn)行注射。

Q: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細(xì)胞清除？A:產(chǎn)品可以用于體外巨噬細(xì)胞的清除，但是這種方法比較適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。主要是由于在體外培養(yǎng)過程中，從死亡細(xì)胞釋放的氯磷酸或者是從脂質(zhì)體中“滲漏”出來氯磷酸，會一直存在于培養(yǎng)基中，但是在體內(nèi)，氯磷酸的半衰期很短，很快就會被腎臟清除。雖然游離的氯磷酸不會進(jìn)入細(xì)胞也不會進(jìn)入脂質(zhì)體，但是一旦他們在培養(yǎng)基中積累就會慢慢地進(jìn)入細(xì)胞中。

Q:在靜脈注射Clodronate liposomes后動物很快就死亡了，是什么原因？A:一方面有可能是動物注射了不均一的脂質(zhì)體懸液。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質(zhì)體在體外一段時間后會發(fā)生沉降。如果在很長一段時間內(nèi)需要一次注射多只動物，那么脂質(zhì)體便會在注射器中發(fā)生沉淀，形成不均一懸液，這樣一來，只注射的計量與后一只注射的計量就會發(fā)生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質(zhì)體剛從冰箱取出后，沒有恢復(fù)到室溫。

Q:動物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了？A：這個可能是受到細(xì)菌的污染，體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞后會增加例如病毒粒子，細(xì)菌或者酵母感染的幾率。

Q:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細(xì)胞并沒有*消失？A：大鼠中成熟的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)ED1和ED2雙陽性，但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細(xì)胞也是ED1+，但是呈現(xiàn)ED2-。因此，所有ED2+的細(xì)胞都可以被*清除，但是ED1+的細(xì)胞卻只能被部分清除，清除的比率取決于前體/成熟巨噬細(xì)胞的比例。

Q: Clodronate liposomes沒有達(dá)到期望的效果？A：氯磷酸脂質(zhì)體都是大批量的生產(chǎn)，每批次都會對氯磷酸的濃度以及一些可能的污染物進(jìn)行檢測，確保無誤后才會銷售給客戶。另外，脂質(zhì)體容易收到溫度的影響。正確的運(yùn)輸和儲存方式是4~8℃，懸液既不能被凍存，也不能被加熱超過30℃。自收到貨物起，需要在3個月內(nèi)使用完，不然有可能會影響使用的效果。

Q:在靜脈注射時，能不能增加注射的體積？A：靜脈注射時需要依據(jù)動物的體重，不能超過0.1ml/10mg，但是進(jìn)行腹腔注射可以適當(dāng)?shù)脑黾幼⑸涞捏w積。皮下注射需要根據(jù)注射位點(diǎn)的容量進(jìn)行決定。